De Gurupá partiu, em outubro de 1637, comandada por Pedro Teixeira, uma expedição oficial com o objetivo de explorar um rio dominado por mulheres cavaleiras e guerreiras - o rio das Amazonas.

Esta incursão, considerada por muitos como a maior façanha sertanista da região, contava com 47 grandes canoas, 70 soldados e 1200 índios flecheiros. Observando a área, Teixeira buscou viabilizar o acesso à região peruana por via atlântica. Neste trajeto, Belém seria a porta de entrada e, por isto mesmo, deveria ser muito bem guardada.

A expedição - composta, entre outros, pelo cronista Maurício de Heriarte e alguns religiosos importantes, como o capelão franciscano Agostinho das Chagas - subiu os rios Amazonas e Negro onde deixou parte do grupo. Prosseguindo, alcançou Quito, em outubro de 1638. Pedro Teixeira tomava posse das terras em nome do rei de Portugal, embora este Reino ainda estivesse sob o domínio espanhol. Favorecidos pelas boas condições de navegação, aqueles homens aventureiros deparavam-se a todo instante com riquezas naturais da flora amazônica como o urucu, primeira especiaria a ser exportada para a Europa. Pousavam onde era possível, conduzidos por índios remeiros, montando acampamentos improvisados e navegando sempre nas mesmas horas do dia.

Já na viagem de volta, em uma das margens do Rio Napo, na confluência com o Rio Aguarico, Pedro Teixeira fundou o povoado da Franciscana (16 de agosto de 1639) que, conforme as instruções que constavam no seu Regimento, deveria servir (...) "de baliza aos domínios das duas Coroas (de Espanha e Portugal)".

Esta expedição foi descrita no livro Novo Descobrimento do Grande Rio das Amazonas, editado em Madri em 1641. O governo espanhol mandou imediatamente recolher e destruir a publicação. Preocupava-se com a divulgação da rota para as minas peruanas e com as pretensões territoriais portuguesas relacionadas à sua Colônia na América, sobretudo no momento da Restauração. Esta medida, entretanto, não impediu que, mais tarde, a expedição de Pedro Teixeira fosse usada pela Coroa lusitana para reivindicar a posse da Amazônia.

No entanto, para o padre João Daniel, que ali já vivia, o verdadeiro "tesouro escondido" eram os nativos, cujas almas podiam ser convertidas.

Alguns capitães e sertanistas experientes, como Antônio Raposo Tavares, Manuel Coelho e Francisco de Melo Palheta, passaram a percorrer o Amazonas e seus afluentes descobrindo comunicações fluviais, atingindo aldeamentos espanhóis na região oriental da Bolívia, e coletando sem cessar as especiarias, com ajuda dos nativos.

Também estabeleceram algumas feitorias e postos de pesca. Combateram e foram combatidos por diversas tribos; vencedores, escravizaram milhares de índios.

As atividades desenvolvidas por sertanistas e capitães, assim como por franciscanos, carmelitas, mercedários e jesuítas, foram importantes na expansão territorial, na conquista e na consolidação do domínio português.